Сотрудничающий центр гриппа ВОЗ на базе Центра контроля и профилактики заболеваний (CDC), Атланта, США, предоставляет протокол детального пиросеквенирования М2 вируса гриппа А(H1N1) для тестирования восприимчивости вируса гриппа А(H1N1) к антивирусным препаратам.
Данный документ содержит обновление, касающееся протокола пиросеквенирования для тестирования антивирусной восприимчивости, опубликованного 29 апреля 2009.
CDC
Специалисты молекулярной эпидемиологии
Отделение контроля и диагностики вирусных заболеваний
Центры контроля и профилактики заболеваний,
Национальный центр по иммунопрофилактике и надзору за респираторными инфекциями (NCIRD) и
Координационный центр по инфекционным заболеваниям (CCID),
Отделение гриппа
Название SOP (Standard operating procedure - стандартное проведение процедуры): Протокол детального пиросеквинирования М2 свиного вируса гриппа H1N1
Дата вступления в силу: 11 мая 2009
Пиросеквенирование гена М2 для выявления резистентности к препаратам производным адамантана (амантадин и ремантадин)
ОТ-ПЦР праймеры (20 мкм):
sw-M2-F670, AGC TCC AGT GCT GGT CTG AAA G
sw-M2-R900-biot, GAC TCA GGC ACT CCT TCC GTA GAA
Праймер последовательности (100 мкм):
sw-M2-F747-seq, GCG ATT CAA GTG ATC C
Протокол ОТ-ПЦР: Использование системы Invitrogen Superscript III одношаговой ОТ-ПЦР с HiFi Taq-полимеразой.
Объем мкл
2Х реакционная смесь
25
Superscript III HiFi Taq-
1
Прямой праймер (20мкм)
1
Обратный праймер (20 мкм)
1
Ингибитор РНКазы
0.5
Вода, не содержащая нуклеаз
16.5
Итоговый объем\образцы
45
Образец
5
Итоговый объем
50
Параметры цикличности ПЦР:
Температура
Длительность
50
30 минут
94
2 минуты
94
15 секунд
45 циклов
55
30 секунд
68
60 секунд
68
5 минут
4
задержка
Протокол пиросеквинирования:
Использование PyroGold реагентов (для 96 образцов)
Реакция связывания
Связывающий буфер: 4 мл.
Дистиллированная вода (Н2О): 2 мл.
Гранулы сефарозы (хорошо перемешанные): 300 мкл.
Смесь, хорошо перемешанная в мешалке.
Внести 60 мкл связывающего буфера в каждую лунку чистого 96-луночного планшета для ОТ-ПЦР (использовать планшет с 12 рядами).
Добавить 20 мкл реагентов ОТ-ПЦР в соответствующие лунки, содержащие связывающий буфер.
Накрыть плашку фотолентой.
Потрясти плашку, по крайней мере, 10 минут.
Реакция отжига:
Буфер для отжига: 4.4 мл.
Праймер последовательности: 20мкл (sw-M2-F747 seq) на 100 мкм.
Перемешать в мешалке и добавить 40 мкл реакции отжига в каждую лунку 96-луночного мягкого планшета для пиросеквирования.
Порядок разделения:
цикличный 60 (CATG\GT).
Используемый модуль:
SQA (анализ последовательности).
Анализируемая последовательность:
Целью пиросеквинирования М2 является сравнение участков сезонных вирусов гриппа H1N1 и H3N2 с исходным образцом свиного вируса гриппа 2009 H1N1: (при сравнении с сезонным вирусом H1N1 наблюдается отличие в один нуклеотид и одну аминокислоту, как это показано и выделено красным цветом ниже).
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Н3:
P
AC CCG
L
CTT
V
GTT
V
GTT
A
GCC
A
GCG
N
AAT
I
ATC
I
ATT
G
GGG
I
ATC
L
TTG
H
CAC
L
TTG AT
Н1:
P
AC CCT
L
CTT
V
GTT
V
GTT
A
GCC
A
GCA
S
AGT
I
ATA
I
ATT
G
GGG
I
ATT
V
GTG
H
CAC
L
CTG AT
swН1:
P
AC CCT
L
CTC
V
GTC
I
ATT
A
GCA
A
GCA
N
AAT
I
ATC
I
ATT
G
GGG
I
ATC
L
TTG
H
CAC
L
CTG AT
Установленные маркеры резистентности к блокаторам М2 (амантадин и ремантадин):
L26F (CTT\C к TTT)
V27A (GTT к GCT)
A30V\T (GCG к GTG), или GCN к GTN, GCG к ACG
S31N (AGT\C к ATT\C)
G34E (GGG к GAG)
Исходный образец вируса свиного гриппа 2009 H1N1 резистентен к препаратам производным адамантана и имеет изменения S31N и соответственно измененный М2 белок (AGT---AAT).