Протокол детального пиросеквенирования NА-Н274 вируса гриппа А (H1N1) для тестирования восприимчивости вируса гриппа А (H1N1) к антивирусным препаратам
Сотрудничающий центр гриппа ВОЗ на базе Центра контроля и профилактики заболеваний (CDC), Атланта, США, предоставляет протокол детального пиросеквенирования NA-H274 вируса гриппа А (H1N1) для тестирования вируса гриппа А (H1N1) к антивирусным препаратам.
Данный документ содержит обновление, касающееся протокола пиросеквенирования для тестирования антивирусной восприимчивости, опубликованного 29 апреля 2009.
CDC
Специалисты молекулярной эпидемиологии
Отделение контроля и диагностики вирусных заболеваний
Центры контроля и профилактики заболеваний,
Национальный центр по иммунопрофилактике и надзору за респираторными инфекциями (NCIRD) и
Координационный центр по инфекционным заболеваниям (CCID),
Отделение гриппа
Название SOP (Standard operating procedure - стандартное проведение процедуры): Протокол детального пиросеквинирования NA-H274 свиного вируса гриппа H1N1
Дата вступления в силу: 12 мая 2009
Пиросеквенирование гена NA для выявления резистентности к препарату озельтамивир (oseltamivir), обусловленной мутацией H274Y (H275Y в N1)
ОТ-ПЦРпраймеры (20 мкм):
Uni-sw-N1-B-F780, GGG GAA GAT TGT YAA ATC AGT YGA
Uni-sw-N1-B-R1273-biot, CWA CCCA GAA RCA AGG YCT TAT G
Праймерпоследовательности (100 мкм):
Uni-sw-N1-B-F804-seq, GYT GAA TGC MCC TAA TT
Протокол ОТ-ПЦР: Использование системы Invitrogen Superscript III одношаговой ОТ-ПЦР с HiFi Taq-полимеразой.
Объем (мкл)
2Х реакционная смесь
25
Superscript III HiFi Taq-
1
Прямой праймер (20мкм)
1
Обратный праймер (20 мкм)
1
Ингибитор РНКазы
0.5
Вода, не содержащая нуклеаз
16.5
Итоговый объем\образцы
45
Образец
5
Итоговый объем
50
Параметры цикличности ПЦР:
Температура
Длительность
50
30 минут
94
2 минуты
94
15 секунд
45 циклов
55
30 секунд
68
60 секунд
68
5 минут
4
задержка
Протокол пиросеквинирования:
Использование PyroGold реагентов (для 96 образцов)
Реакция связывания
Связывающий буфер: 4 мл.
Дистиллированная вода (Н2О): 2 мл.
Гранулы сефарозы (хорошо перемешанные): 300 мкл.
Смесь, хорошо перемешанная в мешалке.
Внести 60 мкл связывающего буфера в каждую лунку чистого 96-луночного планшета для ОТ-ПЦР (использовать планшет с 12 рядами).
Добавить 20 мкл реагентов ОТ-ПЦР в соответствующие лунки, содержащие связывающий буфер.
Накрыть плашку фотолентой.
Потрясти плашку, по крайней мере, 10 минут.
Реакция отжига:
Буфер для отжига: 4.4 мл.
Праймер последовательности: 20мкл (Uni-sw-N1-B-F804-seq) на 100 мкм.
Перемешать в мешалке и добавить 40 мкл реакции отжига в каждую лунку 96-луночного мягкого планшета для пиросеквирования.