Протокол полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ, Realtime RT-PCR) CDC для выявления и исследования вируса гриппа А(H1N1)

ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

28 апреля 2009 новая версия 1
(30 апреля 2009) новая версия 2
(6 октября 2009)

Сотрудничающий Центр гриппа ВОЗ на базе Центра контроля и профилактики заболеваний (CDC), Атланта, США, представляют протокол полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ, Realtime RT-PCR) для выявления и исследования вируса гриппа А(H1N1)

Протокол полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ, Realtime RT-PCR) Центра контроля и профилактики заболеваний США (CDC) для выявления и исследования вируса гриппа А(H1N1) (версия 2009)

Общие комментарии

Ограничение ответственности: Название поставщиков и производителей упоминается в качестве примера источника подходящих товаров. Включение их в протокол не является свидетельством Центров контроля и профилактики заболеваний, подтверждающих качество товара

Допущения: Проведение данного анализа требует наличие базовых знаний методов ОТ-ПЦР.

Принцип метода: Протокол полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ, Realtime RT-PCR) Центра контроля и профилактики заболеваний (CDC) для выявления и исследования свиного гриппа включает набор олигонуклеотидных праймеров и гидролизных зондов с двумя метками (Taqman®), которые предназначены для использования при проведении анализов ОТ-ПЦР РВ для качественного выявления и исследования in vitro вируса свиного гриппа в образцах из дыхательных путей и вирусных культурах. Комплект праймеров и зондов InfA предназначен для универсального определения вирусов гриппа группы А. Комплект праймеров и зондов swInfA предназначен специально для выявления всех вирусов свиного гриппа A. Комплект праймеров и зондов swH1 разработан специально для выявления свиного гриппа H1. Данный анализ проводится при необходимости подтвердить наличие вируса гриппа группы А в образцах (не поддающихся типированию), взятых из дыхательных путей больных с подозрением на вирус свиного гриппа группы А.

Ограничения по использованию протокола: Данные протоколы были оптимизированы с применением количественной одношаговой ОТ-ПЦР с зондами (комплект для количественной одношаговой ПЦР Invitrogen SuperScriptTMIII Platinum®), которая дала сопоставимые результаты с термоциклерной системой 96-луночного формата, такой как ПЦР в реальном времени Applied BiosystemsTM (Applied BiosystemsTM real-time PCR 7000, 7300, 7500, др.), детекторные системы ПЦР в реальном времени BioRad (BioRad real-time PCR iQTM или iQ5TM) или оборудование для количественной ПЦР Stratagene (Stratagene QPCR MX4000, MX3000 или MX3005).

Информация по технике безопасности: Обработка образцов должна проходить в соответствии с существующими государственными нормами по биологической безопасности.

Допустимые образцы: Образцы из дыхательных путей, включая бронхоальвеолярный лаваж, трахеальный аспират, мокроту, назофарингеальный или орофарингеальный аспираты или смывы и назофарингеальный или орофарингеальный мазки. Взятие мазков проводиться с помощью тампонов только из синтетического материала (полиэстер или дакрон (Dacron®)) на алюминиевых или пластиковых стержнях. Использование ватных тампонов и деревянных стержней для забора образцов не рекомендуется. Образцы, взятые тампонами, импрегнированными альгинатом кальция, не допускаются.

Критерии отбраковки:

Образцы, которые не хранились при температуре 2-4°C (≤ 4 дней) или не были заморожены при температуре -70°C и ниже.
Образцы, не вошедшие в список допустимых образцов, представленный выше.

Выделение нуклеиновых кислот: Проведение анализов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, методом ОТ-ПЦР зависит от количества и качества матричных РНК в образцах. Перед тестированием образцов методики выделения РНК должны быть признаны годными и проверены на выделение и чистоту.

Было показано, что имеющиеся в продаже комплекты для выделения РНК, включая комплект QIAamp® Viral RNA Mini Kit или RNeasy® Mini Kit (QIAGEN), комплекты Roche MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit, MagNA Pure LC RNA Isolation Kit II и Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit, позволяют синтезировать высокоочищенную РНК при соблюдении рекомендованных производителем процедур для экстрагирования образцов.

Материалы

Реагенты:

1. Комплект гидролизных зондов (например, Taqman®) для одношаговой количественной ОТ-ПЦР

Комплект для одношаговой количественной ПЦР Invitrogen SuperScript™III Platinum® (кат. № 11732-020 или 11745-100).

2. Стерильная дистиллированная вода молекулярно-биологического качества (не содержащая РНКазы и ДНКазы)

3. Прямой и обратный праймеры (40 мкм)

4. Зонды с двумя метками (10 мкм)

5. Образцы положительного контроля

Вспомогательные материалы:

Лабораторный разметочный карандаш
Охлаждающий контейнер для микроцентрифужных пробирок (1,5 мл) и реакционных пробирок (0,2 мл) 96-луночного модуля для ПЦР
20-мкл и 200-мкл регулируемые пипетки и наконечники с аэрозольным барьером
Стрипы и планшеты для реакционных пробирок ПЦР (0,2мл)
Оптические крышечки для стрипов
Стерильные свободные от нуклеазы 1,5 мл микроцентрифужные пробирки
Одноразовые перчатки без талька

Оборудование:

Микроцентрифуга
Мешалка
Детекторный модуль ПЦР в реальном времени с 96-луночным реакционным модулем амплификатора.

Порядок действий

Подготовка:

1. Предотвращение контаминации образцов

Из-за высокой чувствительности анализов с использованием флуорогенных 5’-нуклеаз во избежание ложноположительных амплификаций при проведении данных анализов необходимо предпринимать особые меры предосторожности.